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组织研磨仪

简要描述:补充:如果需要提取的样品比较多(比如1g),研磨好的样品在后续的提取中,需要转移到大的epp管中,研磨时可以加入较少的抽提液,研磨完毕按照1g样品10ml提取液补充抽提液,进行后续的操作。

  • 产品型号:GT100
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2021-03-24
  • 访  问  量:39
详情介绍
 一、 实验试剂:

 

1.CTAB抽提液:

2%w/vCTAB

100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

20 mmol/L EDTA(pH8.0)

1.4 mol/L NaCl

抽提含多酚较多的植物材料时(比如木本植物),上述抽提液中可另加入2%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

抽提液于室温保存,可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入约2%-3%v/v)的β-巯基乙醇。

2、醋酸钠:

3 mol/L NaAc

用冰乙酸调pH值至4.8-5.2

3TE溶液:

4、其它:

无水乙醇,异丙醇,75%乙醇,酚:氯仿:异戊醇(25241),氯仿:异戊醇(241),β-巯基乙醇,重蒸水。

二、 实验步骤

1. 样品研磨

1) 1g的样品放入2ml ep管中

2) 加入1-25mm研磨珠

3) 加入1mlCTAB 抽提液

4) 将加有样品的ep管放入高通量组织研磨仪的适配器中,盖好

5) 将研磨转速调到1800,设定研磨时间为90秒(可根椐样品的研磨的难易程度来调节,此数据是以银杏落叶为样本得出)

6) 启动研磨仪对样品进行研磨(根据不同的样品,本身性质不同,需要对研磨频率和研磨时间进行适当的调整)

2. DNA的粗提

1) 将研磨好的样品取出于65水浴45min,中途间隔(轻柔)振荡三次混匀

2) 冷却后加入等体积氯仿:异戊醇(241),轻柔颠倒混匀使乳化10min

3) 7000g-8000g离心10min18-20

4) 吸取上清于另一干净的离心管中

5) (根据需要可用氯仿:异戊醇如上法重复抽提一次,吸取上清)

6) 加入与上清液等体积(且已于-20预冷的异丙醇,颠倒混匀,约12分钟后应有白色絮状沉淀出现(若没有,则加入上清液1/51/10体积的pH4.8-5.23M NaAc,混匀,于-20冰箱中沉淀30min

7) 离心法沉淀DNA

8) 75%乙醇中漂洗DNA数分钟以上,用Tip头吸干乙醇

9) 1ml 75%乙醇再漂洗一次

10) 沉淀于室温或64以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明,不要过度干燥

11) 50μlTE溶解沉淀,可用65水浴助溶,DNA粗提物可用于粗略PCR等。

3. DNA的纯化

1) TE溶解的DNA粗提物中入4-10μl RNaseA(40-100μg)

2) 37酶解RNA 1hr65酶解RNA 30min以上

3) 加入50μl酚:氯仿:异戊醇(25241),轻轻颠倒混匀10min

4) 10000g以上常温离心10min,吸取上清

5) 加入50μl仿氯:异戊醇(241)轻轻颠倒10min

6) 10000g以上常温离心10min,吸取上清 (根据需要可重复用氯仿:异戊醇如上法再抽提1-2次,以充分去除蛋白和酚)

7) 向上清中加入1/5-1/10体积的pH4.8-5.23M NaAc,并加入2.5倍体积无水乙醇,于-20沉淀30min以上

8) 12000g4低温离心10min,吸干液体

9) 沉淀用75%乙醇漂洗二次

10) 沉淀于室温或64以下恒温箱中干燥片刻至刚开始出现半透明状,勿过度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA,可于65水浴助溶

11) 5μl DNA电泳检查DNA的质量

12) 100-500倍稀释后于分光光度计上测定OD260OD280,分析DNA的浓度和质量

13) 保存DNA-20

补充:如果需要提取的样品比较多(比如1g),研磨好的样品在后续的提取中,需要转移到大的epp管中,研磨时可以加入较少的抽提液,研磨完毕按照1g样品10ml提取液补充抽提液,进行后续的操作。

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